Con el s. XVI llegaron a Cardeña los cambios que supuso su incorporación a la Congregación vallisoletana de San Benito, que también conllevó modificaciones arquitectónicas en el conjunto. El monasterio se renovó hasta presentar una nueva imagen que reflejaba los tiempos de bonanza, pero no variaron sus dos singularidades principales: la devoción a los mártires y su vínculo a la figura del Cid, que en esta época adquieren, además, un mayor protagonismo.
La Orden de San Benito contaba con normas para las intervenciones en las distintas casas. Las actuaciones importantes debían ser comunicadas previamente para ser aprobadas por personas de confianza, y ejecutarse por maestros reconocidos y bajo la supervisión de un religioso que ejerciese como maestro de obras, una vez garantizada la disponibilidad de financiación.
En la primera mitad del s. XVI, el primer abad tras la integración en la Congregación, Fr. Juan López de Belorado, desarrolló un ambicioso proyecto de obras e intervenciones para adaptar el culto a la nueva situación. La primera actuación, de 1504, estuvo dirigida a elevar la antigua torre románica, ya que el nuevo templo gótico se alzaba hasta la mitad de su último cuerpo. Así, se levantó el campanario, que presenta arcos de medio punto y espacio interior cubierto con una bóveda cuatripartita, ménsulas adornadas con hojas y clave decorada con las llaves cruzadas, símbolo de San Pedro. El cuerpo se finaliza en una cornisa con bolas, pináculos floreados en los ángulos y gárgolas, y la torre se remata con un chapitel que se mantuvo hasta principios del s. XX.
También en 1504 se construyó la Capilla de San Benito en la base de la torre, con acceso a través de un arco ligeramente apuntado y con ornamento poco profuso. Las jambas presentan finas columnillas y una cenefa de vástagos y hojarascas entre que aparecen pequeños animales; dos arquivoltas presentan motivos de rayos, otra está adornada con festón de hojarasca, y la exterior, con caireles. Los soportes del arco de acceso y de la cubierta son columnas entorchadas con flores y bolas. Todos esos elementos han llevado a atribuir esta obra a Simón de Colonia. Vinculada a esta capilla, la escalera de husillo constituye un alarde de destreza en la ejecución del modelo de "caracol de eje redondo y ojo abierto".
En el mismo año, y como consecuencia de la incorporación a la Congregación de San Benito, en la Sala Capitular se construyó la Capilla de Santa Catalina, abierta en el muro del este, a modo de ábside del resto del espacio, y de autor desconocido, aunque se ha relacionado con la escuela de Simón de Colonia. El acceso se realiza a través de un arco toral de medio punto y doble arquivolta con abundante decoración. El interior está cubierto con bóveda cuatripartita y clave con el escudo del monasterio. En los muros norte y sur de este pequeño espacio se abren dos arcosoleos de medio punto, probablemente con finalidad funeraria, en los que se aprecian restos de policromía. La incorporación a la Orden procedente de Valladolid explica también el cambio del dormitorio común a celdas individuales, realizado en 1519.
Fr. Juan López de Belorado llevó a cabo también numerosas actuaciones relacionadas con bienes muebles del monasterio. Encargó varios retablos, para las capillas colaterales de Nuestra Señora y San Benito (1505), los de San Miguel (1508) y Santiago (1509) y el de Santa Catalina y la Magdalena (1511). El mismo año de su muerte había mandado hacer la sillería del coro bajo, anterior a la de San Benito en Valladolid. Su labor renovadora fue continuada por su sucesor y discípulo Fr. Lope de Frías, quien impulsó algunas de las piezas arquitectónicas más destacadas del cenobio. Entre ellas figura la dependencia destinada a aseo, el aguamanil situado al este de la sacristía, donde sobresale una pila de jaspe rojo protegida por una estructura de bellos elementos renacentistas y con una inscripción que permite conocer el año de su ejecución, 1547. Algunos autores la han atribuido a Diego de Siloé[1], aunque la marcha de este a Granada en 1528 hace pensar en Juan de Vallejo, uno de los arquitectos más brillantes de esta época en Burgos, quien utilizó habitualmente motivos escultóricos presentes en esta pieza.
En el aguamanil, a los lados del lavabo se sitúan dos pilastras cajeadas recorridas por figuras y termes, que enmarcan un espacio cuadrangular con pequeños nichos avenerados laterales. En el frente aparece una cartela con forma de pergamino, entre figuras aladas de gran fuerza expresiva, y la leyenda "Lavamini mundi estote", que remite al libro de Isaías, capítulo 1, versículo 16: "Lavaos, limpiaos, quitad de ante mis ojos la iniquidad de vuestras acciones. Dejad de hacer el mal". Sobre ella, figura la cabeza de un niño en un fondo de escudo que presenta bordes en forma de máscaras en la parte superior y pechinas aveneradas. Como remate, flanqueada por dos musculosas figuras, una estructura semicircular de bella venera diluida en hojas, en la que aparece una cabeza incompleta, probablemente de león, pero que recuerda a una medusa.
También de la etapa de Lope de Frías es la escalera de caracol que da acceso al archivo y la sacristía alta. A diferencia de la de la torre, es del tipo denominado «caracol de Mallorca», de gran dificultad en su ejecución y cuyo autor no ha podido identificarse.
Se ha escrito sobre otra escalera de acceso al claustro pequeño y varias portadas[2], que podría corresponder a los restos conservados al este del conjunto y que pertenecían al patio desaparecido, ubicado al levante del monasterio. En esos restos se aprecian testimonios de una bella puerta adintelada, flanqueada por columnas acanaladas y capitel en forma de tambor. Esta pieza muestra similitudes con el aguamanil, por lo que también remite a Juan de Vallejo, a lo que contribuye también la fecha grabada en la inscripción del dintel, 1548, un año después de la ejecución del aguamanil.
De Frías también concluyó la sillería del coro encargada por López de Belorado e instalada en su emplazamiento en 1541. La describió Berganza: "Este Coro es todo de nogal, admirablemente labrado, con dos ordenes de sillas, altas, y baxas, y todas ellas, de los brazos abaxo con embutidos de primorosa labor y arte. De los brazos arriba, en los respaldos, es de perfecta imagineria de media talla. En las sillas baxas, la imagineria es de medallas; y en las altas, es de cuerpos perfectos. En la coronación de las sillas altas están los retratos de los Emperadores en medallas redondas; y encima de estas por remate están las imagenes de los Profetas de cuerpo entero: y entre unos, y otros cuerpos está el adorno de muchos Canes, y otras labores. Todo lo demás del Coro, como son columnas, y otros dibujos, es de relieve, trabajado con gran arte, y tiene sesenta sillas altas, y baxas"[3]. Aunque se desconoce su autoría, el mismo autor desvela que los propios monjes de la comunidad se implicaron en su factura.
Vinculada a la sillería, se instalaron las gradas del altar mayor, a su vez asociadas con la renovación de la topografía funeraria. El abad encargó los túmulos de la fundadora, doña Sancha, de su hijo Teodorico, del conde Garci Fernández y de su esposa, doña Ava. Pero su intervención más destacada está relacionada con el traslado de los sepulcros del Cid y doña Jimena. Las sepulturas habían sido instaladas frente a la sacristía tras la construcción del nuevo templo gótico y, ahora, al colocarse las gradas del altar mayor fue necesario desplazarlas, operación llevada a cabo el 14 de enero de 1541. Esa actuación disgustó al condestable de Burgos, Pedro Fernández de Velasco, quien solicitó la mediación del rey Carlos I. El monarca ordenó que los restos regresaran a su anterior emplazamiento, con lo que los esposos volvieron a reposar juntos, ya que la tumba de Jimena se había colocado en el claustro.
Los enterramientos quedaron en medio de la Capilla Mayor, junto a los de doña Sancha, Teodorico, el conde Garci Fernández y doña Ava. La presencia del maestro Ochoa de Artiaga en el traslado ha hecho pensar que pudo ser el autor de los sepulcros con las dos figuras yacentes, realizados en el s. XVI. La escultura del Cid lo presenta vestido de guerrero, con rica armadura de gala profusamente decorada y portando su espada, la Tizona. Doña Jimena aparece con ropaje de gruesos pliegues y toca ajustada al rostro; con las manos recogidas en señal de piedad y devoción, y con un perro de lanas acurrucado a los pies, como símbolo de la fidelidad.
En la segunda mitad del s. XVI, los sucesores de Fr. Lope de Frías continuaron con reformas que completaban su programa. Su sobrino, Andrés de Frías, creó el archivo y la sacristía alta; Fr. Juan Ortega Roldán encargó, entre 1561 y 1562, los dos altares colaterales y el reloj de ruedas de la torre; Fr. Juan de Salazar mandó realizar una urna del sagrario del retablo mayor para depositar la reliquias de San Sisebuto y de otros santos; y Fr. Antonio Hurtado, a partir de 1565, acometió la ordenación del espacio interior del templo para evitar el desorden de los sepulcros. Esta última iniciativa dotó al cenobio del primer Panteón de los Reyes, en el brazo sur del transepto, delimitado por una reja de madera, acorde con la mitificación de Cardeña como espacio funerario de personas ilustres.
En 1569, en la etapa de Fr. Andrés de Anzuriza, se culminó la fachada de la iglesia con una cornisa moldurada y, en el eje central, un cuerpo de menor anchura presidido por un vano de medio punto, flanqueado por pilastras cajeadas, a modo de espadaña, y rematado mediante frontón semicircular. A cada lado, ocupando la anchura del cuerpo inferior, se sitúa un antepecho acanalado sobre el que descansan extraños soportes, a modo de basas y capiteles continuos, pero sin fuste intermedio, que se transforman en tambores acanalados en el frontón semicircular. El cuerpo central termina en un pináculo con llamas.
En el cuerpo de remate aparece una hornacina con una talla del Cid, vestido de caballero, con la espada en la mano derecha y, en la izquierda, un escudo en el que están talladas sus armas. En la parte superior figuran dos cabezas de león con una argolla en sus fauces. Y flanqueando la escultura del Campeador, medallones con los rostros en alto relieve del rey Alfonso III y doña Sancha, en la parte del evangelio, y de Teodorico y el conde Garci Fernández, en el de la epístola.
El momento de bonanza que vivía el monasterio en esta centuria, con su incorporación a San Benito, aún permitió otra intervención destacada ante el incremento del número de religiosos. En la última década del s. XVI se ampliaron las dependencias con un cuarto en la parte oeste del conjunto.